1. INTRODUÇÃO
As células podem ser rompidas de
várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de
vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar
por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses
procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de
Golgi e Peroxissomos fiquem intactas e também muitas vesículas derivadas do
retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantenham muito de suas
propriedades bioquímicas originais.
2. OBJETIVO
Separar os componentes celulares
através do fracionamento por centrifugação para o estudo da organização
molecular e do funcionamento da célula.
3. MATERIAL
02 a 03 Folhas de Tradescantia purpurea (manto-de-viúva
ou trapoeraba);
Figura 1: Detalhe da flor de Tradescantia purpurea conhecida
vulgarmente como manto-de-viúva ou trapoeraba (Foto: Guilherme Araújo Lacerda).
01 Amofariz (gral) e 01 pistilo
(ou pires e colher);
02 a 04 tubos de microcentrífuga;
01 Microscópio óptico;
02 Pipetas Pasteur ou conta-gotas;
01 Minicentrífuga (ver prática 001/2013);
05 mL de detergente de louça (líquido ou
gel);
100 mL de Água acidulada (2 a 3 gotas de
vinagre – ou ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água).
4. MÉTODOS
1) Coloque 3 mL de água acidulada em um
almofariz (ou um pires). A razão para usar água acidulada é porque o pigmento
antocianina que iremos separar dos cloroplastos é rosa ou roxo em pH ácido, mas
verde em pH alcalino. Como iremos separar a antocianina da clorofila, que
também é verde, ficará difícil de notar a diferença dos dois pigmentos se por
ventura a água de sua torneira for levemente alcalina.
2) Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de
Tradescantia com um pistilo (ou uma colher);
3) Transfira com uma pipeta de Pasteur a
parte líquida do homogeneizado para um tubo de minicentrífuga e centrifugue
rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores;
4) Transfira o sobrenadante para um novo
tubo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos; Pode-se
ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo,
pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um
precipitado verde, pela presença dos cloroplastos, que são organelas grandes e
por isso vão para o fundo do tubo.
5) Transfira o sobrenadante para um novo
tubo;
6) Com a pipeta Pasteur, ressuspenda o
precipitado (cloroplastos) em água acidulada. Sugira aos alunos que descrevam e
desenhem o que acontece;
7) Acrescente uma gota de detergente no
tubo contendo a solução “verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto;
8) Centrifugue por cinco minutos os tubos
com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”).
9) Observe e descreva o que aconteceu com
o material contido nos tubos. Note que agora os cloroplastos não precipitam
mais, uma vez que deixaram de existir, pois o detergente “desmanchou” as
membranas daquela organela. O líquido do tubo fica “todo verde”, porque ao
destruir os cloroplastos o detergente “libera” a clorofila. Como esta é uma pequena
molécula, a força centrífuga aplicada não consegue precipitá-la, como também
não precipita a antocianina, que também é uma molécula pequena.
5. REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
LORETO, E.L.S.; SEPEL, L.M.N. Atividades experimentais e
didáticas em biologia molecular e celular. 2ª Ed. São Paulo: Sociedade
Brasileira de Genética, 2003. p.27-29.
