Prática 002/2013 - Fracionamento celular – separação de organelas e macromoléculas

1. INTRODUÇÃO

As células podem ser rompidas de várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi e Peroxissomos fiquem intactas e também muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantenham muito de suas propriedades bioquímicas originais.

2. OBJETIVO

Separar os componentes celulares através do fracionamento por centrifugação para o estudo da organização molecular e do funcionamento da célula.

3. MATERIAL

02 a 03 Folhas de Tradescantia purpurea (manto-de-viúva ou trapoeraba);

Figura 1: Detalhe da flor de Tradescantia purpurea conhecida vulgarmente como manto-de-viúva ou trapoeraba (Foto: Guilherme Araújo Lacerda).

01 Amofariz (gral) e 01 pistilo (ou pires e colher);

02 a 04 tubos de microcentrífuga;

01 Microscópio óptico;

02 Pipetas Pasteur ou conta-gotas;

01 Minicentrífuga (ver prática 001/2013);

05 mL de detergente de louça (líquido ou gel);

100 mL de Água acidulada (2 a 3 gotas de vinagre – ou ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água).

4. MÉTODOS

1)    Coloque 3 mL de água acidulada em um almofariz (ou um pires). A razão para usar água acidulada é porque o pigmento antocianina que iremos separar dos cloroplastos é rosa ou roxo em pH ácido, mas verde em pH alcalino. Como iremos separar a antocianina da clorofila, que também é verde, ficará difícil de notar a diferença dos dois pigmentos se por ventura a água de sua torneira for levemente alcalina.

2)    Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de Tradescantia com um pistilo (ou uma colher);

3)    Transfira com uma pipeta de Pasteur a parte líquida do homogeneizado para um tubo de minicentrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores;

4)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos; Pode-se ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo, pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um precipitado verde, pela presença dos cloroplastos, que são organelas grandes e por isso vão para o fundo do tubo.

5)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo;

6)    Com a pipeta Pasteur, ressuspenda o precipitado (cloroplastos) em água acidulada. Sugira aos alunos que descrevam e desenhem o que acontece;

7)    Acrescente uma gota de detergente no tubo contendo a solução “verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto;

8)    Centrifugue por cinco minutos os tubos com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”).

9)    Observe e descreva o que aconteceu com o material contido nos tubos. Note que agora os cloroplastos não precipitam mais, uma vez que deixaram de existir, pois o detergente “desmanchou” as membranas daquela organela. O líquido do tubo fica “todo verde”, porque ao destruir os cloroplastos o detergente “libera” a clorofila. Como esta é uma pequena molécula, a força centrífuga aplicada não consegue precipitá-la, como também não precipita a antocianina, que também é uma molécula pequena.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LORETO, E.L.S.; SEPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas em biologia molecular e celular. 2ª Ed. São Paulo: Sociedade Brasileira de Genética, 2003. p.27-29.