Prática 003/2013 - Cromatografia de pigmentos vegetais em papel

Introdução

Cromatografia é um método de separação de misturas e identificação de seus componentes. Esta separação depende do comportamento dos analitos, parte da amostra que é o foco da análise química, entre uma fase móvel e uma fase estacionária. A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada pelas diferentes forças intermoleculares, incluindo as forças apolar, polar, iônica, bipolar, gravitacional e específicas interações de afinidade e solubilidade. 

Objetivo
Extrair e diferenciar diferentes pigmentos vegetais pela técnica de cromatografia em papel. 

Material

02 Folhas da herbácea Tradescantia

Figura 1: Folha da planta ornamental herbácea Tradescantia sp. (Malvaceae) utilizada para extração dos pigmentos vegetais (Foto: Alexsandro G. dos Santos e Márcio H. R. de Carvalho).

01 Almofariz e Pistilo

10 mL de Álcool Etílico Comercial (líquido)

10 mL de Solução de Acetona Comercial

02 Folhas de Papel de Filtro nº 102

02 Câmaras Cromatográficas (Frascos de vidro com tampa seladora)

01 Proveta de 50 mL (ou caneca de medida)

02 Placas de Petri (ou pires)

01 Tesoura

01 Cronômetro (de celular ou relógio).

Métodos

1) Depois de lavadas, uma das folhas de Tradescantia será colocada no almofariz e amassada com o auxílio do pistilo acrescentando-se, em pequenas quantidades, 10 mL de álcool etílico medidos com a proveta. Formando-se, então, um extrato foliar etanoico;

2) Logo após transferir o extrato para uma Placa de Petri;

3) Cortar o Papel de Filtro no tamanho 9 X 9 cm e dobrar ao meio colocado-o em posição vertical sob o conteúdo de extrato foliar etanólico, deixando-o por 5 minutos cronometrados;

4) Amassar a outra folha de Tradescantia com o pistilo no almofariz acrescentando, dessa vez, acrescentando-se 10 mL de solução de acetona em pequenas quantidades. Obteremos então um extrato foliar cetônico que será transferido para a outra câmara de cromatografia;

5) Repetir o processo do subitem 3 com o outro papel de filtro dobrado  com o extrato e aguardar os 5 minutos cronometrados.

6) Após os 5 minutos de espera, retirar o papel filtro do extrato foliar etanólico e colocar na posição invertida. Esperar uns minutos para secar e o papel colocado-os na Câmara Cromatográfica para serem aguardados mais 5 minutos.

7) Repetir os processos dos subitens 5 e 6 mas com o  extrato foliar cetônico no lugar do extrato foliar etanólico.

Resultados

Figura 2: Cromatografia em papel do extrato foliar etanólico (Foto: Alexsandro G. dos Santos e Márcio H. R. de Carvalho).

Figura 3: Cromatografia em papel do extrato foliar cetônico (Foto: Alexsandro G. dos Santos e Márcio H. R. de Carvalho).

Figura 4: Notou-se também, nesse experimento, a florescência da clorofila, que mesmo no ambiente externo da folha, continua a reagir a luz (Foto: Alexsandro G. dos Santos e Márcio H. R. de Carvalho).

Discussão

1) Relacione os diferentes pigmentos observados e suas respectivas colorações:

Padrão de Resposta (PR) - Antocianina - cor roxa; clorofila - cor verde; xantofila - cor amarela.

2) Obteve-se diferença nos perfis cromatográficos em relação ao solvente?

PR - Pelo experimento observo-se maior afinidade do solvente etanólico com a antocianina e do cetônico com a clorofila e xantofila.

3) Por que a clorofila emitia florescência mesmo após a extração com solvente? 

PR - Pela reação da mesma em excitação molecular aos fótons da luz natural do ambiente.

Referências bibliográficas

LACERDA, Guilherme Araújo. Manual de aulas práticas em biologia celular. Janaúba: UNIMONTES,   Faculdade de Zootecnia, 2013. 31f.

PRADO, Carlos Henrique B. de A.; CASALI, Carlos A. Fisiologia vegetal: práticas em relações hídricas, fotossíntese e nutrição mineral. Barueri, SP: Manoel, 2006.

RIBEIRO, Núbia Moura; NUNES, Carolina Rodeiro. Análises de pigmentos de pimentões por cromatografia em papel. QUÍMICA NOVA NA ESCOLA, N° 29, AGOSTO 2008. p.34-37.

Prática 002/2013 - Fracionamento celular – separação de organelas e macromoléculas

1. INTRODUÇÃO

As células podem ser rompidas de várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi e Peroxissomos fiquem intactas e também muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantenham muito de suas propriedades bioquímicas originais.

2. OBJETIVO

Separar os componentes celulares através do fracionamento por centrifugação para o estudo da organização molecular e do funcionamento da célula.

3. MATERIAL

02 a 03 Folhas de Tradescantia purpurea (manto-de-viúva ou trapoeraba);

Figura 1: Detalhe da flor de Tradescantia purpurea conhecida vulgarmente como manto-de-viúva ou trapoeraba (Foto: Guilherme Araújo Lacerda).

01 Amofariz (gral) e 01 pistilo (ou pires e colher);

02 a 04 tubos de microcentrífuga;

01 Microscópio óptico;

02 Pipetas Pasteur ou conta-gotas;

01 Minicentrífuga (ver prática 001/2013);

05 mL de detergente de louça (líquido ou gel);

100 mL de Água acidulada (2 a 3 gotas de vinagre – ou ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água).

4. MÉTODOS

1)    Coloque 3 mL de água acidulada em um almofariz (ou um pires). A razão para usar água acidulada é porque o pigmento antocianina que iremos separar dos cloroplastos é rosa ou roxo em pH ácido, mas verde em pH alcalino. Como iremos separar a antocianina da clorofila, que também é verde, ficará difícil de notar a diferença dos dois pigmentos se por ventura a água de sua torneira for levemente alcalina.

2)    Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de Tradescantia com um pistilo (ou uma colher);

3)    Transfira com uma pipeta de Pasteur a parte líquida do homogeneizado para um tubo de minicentrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores;

4)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos; Pode-se ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo, pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um precipitado verde, pela presença dos cloroplastos, que são organelas grandes e por isso vão para o fundo do tubo.

5)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo;

6)    Com a pipeta Pasteur, ressuspenda o precipitado (cloroplastos) em água acidulada. Sugira aos alunos que descrevam e desenhem o que acontece;

7)    Acrescente uma gota de detergente no tubo contendo a solução “verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto;

8)    Centrifugue por cinco minutos os tubos com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”).

9)    Observe e descreva o que aconteceu com o material contido nos tubos. Note que agora os cloroplastos não precipitam mais, uma vez que deixaram de existir, pois o detergente “desmanchou” as membranas daquela organela. O líquido do tubo fica “todo verde”, porque ao destruir os cloroplastos o detergente “libera” a clorofila. Como esta é uma pequena molécula, a força centrífuga aplicada não consegue precipitá-la, como também não precipita a antocianina, que também é uma molécula pequena.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LORETO, E.L.S.; SEPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas em biologia molecular e celular. 2ª Ed. São Paulo: Sociedade Brasileira de Genética, 2003. p.27-29.

Prática 001/2013 - Como construir uma minicentrífuga?

Objetivo

Construir uma minicentrífuga a partir de materiais alternativos.

Introdução

A centrifugação é um processo de separação em que uma amostra fluida é submetida a um aparelho centrifugador ou centrífuga a fim de se promover a separação dos componentes via sedimentação dos líquidos imiscíveis de diferentes densidade. É usada em diferentes aplicações laboratoriais, industriais e domésticas. Para a realização de algumas práticas laboratoriais é essencial o uso de minicentrífugas para separação de substâncias. A inexistência de material adequado é, muitas vezes, o principal motivo para a não execução de atividades práticas. Por isso, descreveremos a seguir como é possível construir tal equipamento utilizando-se materiais alternativos. 

Material

01 CAP de PVC (50 mm) - do tipo empregado para encanamento de esgoto, disponível em lojas de material de construção. Outro por plástico qualquer, de tamanho adequado, pode substituir este CAP;
01 Motor elétrico (12 volts) - recomendamos motor de secador de cabelo, por ter boa rotação e força, além de ser resistente, mas outros pequenos motores também podem ser usados (motor de DVD player ou outros).

Atenção - para atividade em sala de aula, motores mais potentes (120 ou 220 volts) devem ser evitados por motivos de segurança.

01 Fonte contínua de +/- 12 volts (transformador) e fio de cobre;

01 Pequena "caixa" plástica que encaixe o motor o mais firme possível (nossa sugestão é o tubo plástico que vem com embalagem para filme de fotografia 35 mm);
01 Tampa plástica com aproximadamente 70 mm de diâmetro - muito usada em filtros de café solúvel, ou outra tampa de tamanho aproximado e com dureza suficiente para suportar as perfurações sem deformar (01 CAP de menor diâmetro que a base também funcionará);
04 Tubos de microcentrífuga (tipo eppendorfs);
01 Resina (massa) epóxi (Ex.: Durepoxi®);

100 g de mistura de cimento e areia.

Procedimento

1) O corpo (base) da centrífuga pode ser feito com um CAP de PVC. Primeiramente, faça um pequeno furo na lateral do CAP; Nesse furo introduza um arame ou um palito (5 a 7 mm) que chegue até o centro do CAP. A seguir, encha o CAP de PVC com a massa de cimento e depois, no cimento ainda úmido, coloque (bem no centro) a caixa plástica em que será encaixado o motor;
2) Deixe o cimento secar (um ou dois dias) e depois retire a caxa plástica e o material usado para preencher o furo;

3) Faça um pequeno furo na "caixa" plástica em que ficará o motor e passe pelo espaço deixado pelo arame, no cimento, de tal forma que o fio saia pelo orifício feito na lateral do CAP;
4) Adapte o motor na caixa plástica. Depois, passe o fio do motor pelo espaço deixado pelo arame, no cimento, de tal forma que o fio saia pelo orifício feito na lateral do CAP;
5) O rotor da centrífuga será feito da tampa plástica que deverá ter na parte lateral quatro furos de 1,1 cm de diâmetro, para colocar os tubos de microcentrífuga. Como o plástico empregado nas tampas é duro, quebras e rachaduras durante a excecussão dos furos são comuns (não desanime!).

6) Após a preparação do espaço para colocar os tubos, faça um pequeno furo bem no centro do "rotor" e cole o eixo do motor com a resina epoxi;

7) O transformador de 12 volts pode então ser ligado ao motor e a centrífuga pode ser testada. Pequenos ajustes poderão ser necessários para que a centrífuga fique bem balanceada.

Foto do equipamento montado

Figura 1 –  Minicentrífuga construida a partir de materiais alternativos por Alexsandro e Márcio graduandos em Zootecnia UNIMONTES Janúba, 2-2012 (Foto: Guilherme Araújo Lacerda 2013).

Discussão

a) Defina centrifugação?

Padrão de Resposta (PR) – processo de separação em que uma amostra fluida é submetida a um aparelho centrifugador ou centrífuga a fim de se promover a separação dos componentes via sedimentação dos líquidos imiscíveis de diferentes densidade.

b) Qual técnica laboratorial pode ser utilizada para separar organelas de acordo com seu potencial de sedimentação?

PR – Fracionamento celular.

c) Cite ao menos dois exemplos de centrífugas caseiras e suas aplicações:

PR – A centrifugação é usada pelas máquinas de lavar roupa para retirar água em excesso da roupa. É por isso usada como um dos últimos passos num programa normal de lavagem. A água em excesso é escoada pelos orifícios do tambor da máquina, onde a roupa é retida. Este princípio é também explorado nos secadores de salada, em que os legumes são colocados num cesto dentro de uma caixa, sendo o cesto girado manualmente com recurso a uma manivela. A água é escoada para fora do cesto via pequenos orifícios, assim como feito nas máquinas de lavar.

Referências Bibliográficas

LORETO, E.L.S.; SPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas de Biologia Molecular e Celular. 2ª Ed. São Paulo: Editora da Sociedade Brasileira de Genética, 2003. 82p.