Prática 002/2013 - Fracionamento celular – separação de organelas e macromoléculas

1. INTRODUÇÃO

As células podem ser rompidas de várias maneiras; por exemplo, por intermédio de choque osmótico, pelo uso de vibrações ultra-sônicas e por métodos mecânicos quando são forçadas a passar por um pequeno orifício ou são homogeneizadas. A aplicação cuidadosa desses procedimentos permite que organelas como núcleo, mitocôndrias, complexo de Golgi e Peroxissomos fiquem intactas e também muitas vesículas derivadas do retículo endoplasmático, chamadas microssomos, mantenham muito de suas propriedades bioquímicas originais.

2. OBJETIVO

Separar os componentes celulares através do fracionamento por centrifugação para o estudo da organização molecular e do funcionamento da célula.

3. MATERIAL

02 a 03 Folhas de Tradescantia purpurea (manto-de-viúva ou trapoeraba);

Figura 1: Detalhe da flor de Tradescantia purpurea conhecida vulgarmente como manto-de-viúva ou trapoeraba (Foto: Guilherme Araújo Lacerda).

01 Amofariz (gral) e 01 pistilo (ou pires e colher);

02 a 04 tubos de microcentrífuga;

01 Microscópio óptico;

02 Pipetas Pasteur ou conta-gotas;

01 Minicentrífuga (ver prática 001/2013);

05 mL de detergente de louça (líquido ou gel);

100 mL de Água acidulada (2 a 3 gotas de vinagre – ou ácido acético – em mais ou menos 100 mL de água).

4. MÉTODOS

1)    Coloque 3 mL de água acidulada em um almofariz (ou um pires). A razão para usar água acidulada é porque o pigmento antocianina que iremos separar dos cloroplastos é rosa ou roxo em pH ácido, mas verde em pH alcalino. Como iremos separar a antocianina da clorofila, que também é verde, ficará difícil de notar a diferença dos dois pigmentos se por ventura a água de sua torneira for levemente alcalina.

2)    Esmague nessa solução 2 a 3 folhas de Tradescantia com um pistilo (ou uma colher);

3)    Transfira com uma pipeta de Pasteur a parte líquida do homogeneizado para um tubo de minicentrífuga e centrifugue rapidamente (15 seg) para retirar fibras de celulose e outros resíduos maiores;

4)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Observe que o líquido tem cor marrom. Centrifugue por 5 minutos; Pode-se ver claramente, após a centrifugação, que o sobrenadante é um líquido roxo, pela presença do pigmento hidrossolúvel antocianina. No fundo do tubo fica um precipitado verde, pela presença dos cloroplastos, que são organelas grandes e por isso vão para o fundo do tubo.

5)    Transfira o sobrenadante para um novo tubo;

6)    Com a pipeta Pasteur, ressuspenda o precipitado (cloroplastos) em água acidulada. Sugira aos alunos que descrevam e desenhem o que acontece;

7)    Acrescente uma gota de detergente no tubo contendo a solução “verde” e agite o tubo por mais ou menos um minuto;

8)    Centrifugue por cinco minutos os tubos com o sobrenadante (“solução roxa”) e com o precipitado (“solução verde”).

9)    Observe e descreva o que aconteceu com o material contido nos tubos. Note que agora os cloroplastos não precipitam mais, uma vez que deixaram de existir, pois o detergente “desmanchou” as membranas daquela organela. O líquido do tubo fica “todo verde”, porque ao destruir os cloroplastos o detergente “libera” a clorofila. Como esta é uma pequena molécula, a força centrífuga aplicada não consegue precipitá-la, como também não precipita a antocianina, que também é uma molécula pequena.

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LORETO, E.L.S.; SEPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas em biologia molecular e celular. 2ª Ed. São Paulo: Sociedade Brasileira de Genética, 2003. p.27-29.

Prática 001/2013 - Como construir uma minicentrífuga?

Objetivo

Construir uma minicentrífuga a partir de materiais alternativos.

Introdução

A centrifugação é um processo de separação em que uma amostra fluida é submetida a um aparelho centrifugador ou centrífuga a fim de se promover a separação dos componentes via sedimentação dos líquidos imiscíveis de diferentes densidade. É usada em diferentes aplicações laboratoriais, industriais e domésticas. Para a realização de algumas práticas laboratoriais é essencial o uso de minicentrífugas para separação de substâncias. A inexistência de material adequado é, muitas vezes, o principal motivo para a não execução de atividades práticas. Por isso, descreveremos a seguir como é possível construir tal equipamento utilizando-se materiais alternativos. 

Material

01 CAP de PVC (50 mm) - do tipo empregado para encanamento de esgoto, disponível em lojas de material de construção. Outro por plástico qualquer, de tamanho adequado, pode substituir este CAP;
01 Motor elétrico (12 volts) - recomendamos motor de secador de cabelo, por ter boa rotação e força, além de ser resistente, mas outros pequenos motores também podem ser usados (motor de DVD player ou outros).

Atenção - para atividade em sala de aula, motores mais potentes (120 ou 220 volts) devem ser evitados por motivos de segurança.

01 Fonte contínua de +/- 12 volts (transformador) e fio de cobre;

01 Pequena "caixa" plástica que encaixe o motor o mais firme possível (nossa sugestão é o tubo plástico que vem com embalagem para filme de fotografia 35 mm);
01 Tampa plástica com aproximadamente 70 mm de diâmetro - muito usada em filtros de café solúvel, ou outra tampa de tamanho aproximado e com dureza suficiente para suportar as perfurações sem deformar (01 CAP de menor diâmetro que a base também funcionará);
04 Tubos de microcentrífuga (tipo eppendorfs);
01 Resina (massa) epóxi (Ex.: Durepoxi®);

100 g de mistura de cimento e areia.

Procedimento

1) O corpo (base) da centrífuga pode ser feito com um CAP de PVC. Primeiramente, faça um pequeno furo na lateral do CAP; Nesse furo introduza um arame ou um palito (5 a 7 mm) que chegue até o centro do CAP. A seguir, encha o CAP de PVC com a massa de cimento e depois, no cimento ainda úmido, coloque (bem no centro) a caixa plástica em que será encaixado o motor;
2) Deixe o cimento secar (um ou dois dias) e depois retire a caxa plástica e o material usado para preencher o furo;

3) Faça um pequeno furo na "caixa" plástica em que ficará o motor e passe pelo espaço deixado pelo arame, no cimento, de tal forma que o fio saia pelo orifício feito na lateral do CAP;
4) Adapte o motor na caixa plástica. Depois, passe o fio do motor pelo espaço deixado pelo arame, no cimento, de tal forma que o fio saia pelo orifício feito na lateral do CAP;
5) O rotor da centrífuga será feito da tampa plástica que deverá ter na parte lateral quatro furos de 1,1 cm de diâmetro, para colocar os tubos de microcentrífuga. Como o plástico empregado nas tampas é duro, quebras e rachaduras durante a excecussão dos furos são comuns (não desanime!).

6) Após a preparação do espaço para colocar os tubos, faça um pequeno furo bem no centro do "rotor" e cole o eixo do motor com a resina epoxi;

7) O transformador de 12 volts pode então ser ligado ao motor e a centrífuga pode ser testada. Pequenos ajustes poderão ser necessários para que a centrífuga fique bem balanceada.

Foto do equipamento montado

Figura 1 –  Minicentrífuga construida a partir de materiais alternativos por Alexsandro e Márcio graduandos em Zootecnia UNIMONTES Janúba, 2-2012 (Foto: Guilherme Araújo Lacerda 2013).

Discussão

a) Defina centrifugação?

Padrão de Resposta (PR) – processo de separação em que uma amostra fluida é submetida a um aparelho centrifugador ou centrífuga a fim de se promover a separação dos componentes via sedimentação dos líquidos imiscíveis de diferentes densidade.

b) Qual técnica laboratorial pode ser utilizada para separar organelas de acordo com seu potencial de sedimentação?

PR – Fracionamento celular.

c) Cite ao menos dois exemplos de centrífugas caseiras e suas aplicações:

PR – A centrifugação é usada pelas máquinas de lavar roupa para retirar água em excesso da roupa. É por isso usada como um dos últimos passos num programa normal de lavagem. A água em excesso é escoada pelos orifícios do tambor da máquina, onde a roupa é retida. Este princípio é também explorado nos secadores de salada, em que os legumes são colocados num cesto dentro de uma caixa, sendo o cesto girado manualmente com recurso a uma manivela. A água é escoada para fora do cesto via pequenos orifícios, assim como feito nas máquinas de lavar.

Referências Bibliográficas

LORETO, E.L.S.; SPEL, L.M.N. Atividades experimentais e didáticas de Biologia Molecular e Celular. 2ª Ed. São Paulo: Editora da Sociedade Brasileira de Genética, 2003. 82p.